一.抗凝剂的选择

1.分离出的PBMC需要进行下一步细胞培养（如培养NK、CIK细胞）：选择肝素抗凝剂。由于血浆中的纤维蛋白原活化成有活性的纤维蛋白，纤维蛋白交联成纤维蛋白血凝块，易使PBMC形成细胞团块，不利于细胞的活化。肝素钠抗凝剂可减轻上述情况发生几率。

2.分离出的PBMC无需培养，而是用于其他检测：选择枸橼酸钠抗凝剂，分离效果最佳。

二.对血液的要求

PBMC最佳分离时间为血液离体后2小时内。如达不到2小时内分血条件，请务必于4小时内进行分血步骤，超过4小时很难顺利进行分离。

三.分离液的使用环境

1.分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

2.使用时严格遵守无菌操作规范，并在18℃-22℃环境温度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。

四.血液样本稀释方法

1.稀释方法：1份的PBS或生理盐水加2份的血液进行稀释（PBS:抗凝血＝1:2）；

2.稀释液要求：用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。

五.各种规格离心管的使用方法

1.15ml离心管（包括高效离心管）：

1）最佳比例：5ml分离液 + 4ml稀释过的血液

2）最佳离心条件：20℃环境下，500g离心25min

3）离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）

建议升速（指开始启动→达到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在3分钟左右。

2.50ml离心管（包括高效离心管）：

1）最佳比例：20ml分离液 + 20ml稀释过的血液

2）最佳离心条件：20℃环境下，650g离心30min

3）离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）

建议升速（指开始启动→达到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在3分钟左右。

3.未经稀释的抗凝血分离方法（细胞培养、或需保存血浆推荐用此方法）：

使用50ml离心管（或50ml高效离心管）

1）50ml普通离心管最佳比例：20ml分离液 + 20ml抗凝血；

50ml高效离心管最佳比例：15ml分离液 + 20ml抗凝血；

2）最佳离心条件：20℃环境下，600g离心30min；

3）获得纯度较高的血浆：离心后，吸取血浆层由上至下的2/3处血浆，下1/3处血浆可能包含部分PBMC及少量分离液成分。

使用15ml离心管（或15ml高效离心管）

1）15ml普通离心管最佳比例：5ml分离液 + 5ml抗凝血；

15ml高效离心管最佳比例：4ml分离液 + 5ml抗凝血；

2）最佳离心条件：20℃环境下，600g离心25min；

3）获得纯度较高的血浆：离心后，吸取血浆层由上至下的2/3处血浆，下1/3处血浆可能包含部分PBMC及少量分离液成分；

4）若采血量较少，需小量分离，分离液的量不得少于3ml，抗凝血量在0.2-3ml之间。

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